CRISPR基因编辑技术攻克SMA

脊髓性肌肉萎缩症（SMA）是一种常染色体隐性遗传性疾病，它会导致肌肉萎缩和功能障碍，但认知功能不受影响（图一）。SMA患者将逐渐丧失运动能力，进而影响呼吸和吞咽，最终导致死亡。SMA是婴幼儿最常见的致死性单基因遗传病。SMA在我国新生儿的患病率为万分之一左右，每年我国新增1000 例 SMA 患者，80%的患者在出生后18个月内起病，SMA重症患者如不进行有效救治一般在2岁夭折。自然人群中，约每40-50人就有1个是SMA致病基因携带者。由于SMA为隐性遗传病，携带者不会发病，也不会有任何SMA疾病症状，父母双方都为携带者，其子女患病的概率为25%^{[1, 2]}。

图一、SMA影响运动神经元导致肌肉萎缩

SMN基因可维持运动神经元的正常功能，其家族包含SMN1和SMN2两个成员。SMN1和SMN2在基因水平仅有5个碱基差异，SMN2在第七个外显子上与SMN1相比，存在一个C到T的碱基突变，该突变将导致SMN2在RNA剪切过程中发生外显子跳跃，翻译后产生截断蛋白D7 SMN2,该截断蛋白极不稳定，容易降解（图二）^[3]。正常情况下体内90%的SMN2为截断形式，仅有10% SMN2蛋白可表达全长。但这些SMN2蛋白量无法让运动神经元存活^{[4, 5]}。在正常人中，SMN1是正常表达，其表达量足以维持正常的神经元功能，然而在SMA患者中，SMN1基因普遍发生第七外显子缺失或颠换，进而导致SMN1蛋白失活，最终导致运动神经元萎缩。除此之外，SMN1基因突变或外显子重排也是其致病因素^{[6, 7]}。

图二、SMN基因RNA剪切

由于SMA具有较高发病率及严重致病性，且治疗成本极高，因此需及时筛查，目前有效的手段包括DHPLC、PCR和MLPA，用以检测SMN基因突变或拷贝数变化，上述技术可检测出95%的SMA潜在患者，但对于SMN基因数量未发生变化但发生外显子重排的情况，并不容易检测^[8]。

目前已有3款针对SMA的上市药物，分别为渤健公司的诺西那生（Nusinersen）、罗氏公司的利司扑兰（Risdiplam）和诺华公司的Zolgensma。诺西那生作为第一款SMA药物于2016年率先上市，其作用原理为其作为反义寡核苷酸类药物，以碱基配对的方式与未剪接的SMN2 RNA结合，降低其被剪切的机会从而间接提高全长SMN2的表达水平。诺西纳生钠注射液第一年需注射6剂，之后每年需要注射3剂，患者需终身用药。2019年诺西那生钠在中国上市，价格为70万人民币一剂。2022年1月1日，诺西那生钠注射液被纳入中国医保，价格由每剂70万元降到3.3万元。经医保报销后，个人仅需几千元支付。

利司扑兰是治疗SMA的口服药物，该药物是一种哒嗪衍生物，可抑制SMN2 第七号外显子剪切，导致体内功能性SMN蛋白的浓度增加。利司扑兰可透过血脑屏障，分布于中枢神经系统和全身。利司扑兰2020年于美国率先上市，并与2021年在中国上市售价6.38万元60mg/瓶， 2023年1月18日，经国家医保谈判每瓶降到3780元。利司扑兰需每日服用，每次约为5mg。

Zolgensma作为史上最贵罕见病药物于2019年以210万美元一针的价格最先在美国上市，2022年9月Zolgensma落地中国，目前尚未进入医保。Zolgensma疗法是通过腺相关病毒 (AAV)将正常的SMN1基因导入到患者体内，缓解其运动神经元障碍。Zolgensma疗法适用于治疗2岁以下SMA患者，诺华公司宣称患者只需接受一次静脉注射，就可实现SMN蛋白长期细胞表达，进而缓解甚至治愈SMA。

尽管针对 SMA 的疗法有所发展，但目前的治疗方法存在局限性并且不是永久治愈方法。例如，利司扑兰是一种每日口服的小剂量药物，可以通过靶向 hnRNP G 的置换来增强 SMN2 表达的分子剪接修饰剂，但是这不是 SMA 的最终治愈方法^[9]。诺西那生的间歇性鞘内注射方案不会改变可能在SMA中起作用的外周组织中的 SMN2 表达^[10]。 同样，使用AAV表达载体的Zolgensma药物同样面临多种挑战，包括未知寿命的AAV 转基因表达，以及由于细胞分裂导致的AAV稀释最终导致功能衰减；此外，来自广谱启动子的 SMN1 的持续超生理表达可能会导致毒性^[11-13]。另外，由于诺华公司2010年发表在Nature biotechnology 关于Zolgensma疗法的动物实验结果，由于虚假陈述遭到撤稿^[14]，2022年8月2名SMA儿童在接受Zolgensma约5-6周后，因急性肝功能衰竭死亡^[15]，上述结果可能会动摇患者对Zolgensma的信心。虽然现有疗法已将先前与SMA相关的高婴幼儿发病率和死亡率降至最低，但SMN蛋白表达的范围和持久性仍需进一步改进。由于目前来看已经获批的SMA治疗药物，仍需终身用药，因此永久增加SMN水平的单剂量疗法需求尚未得到满足。

由于SMA患者或正常人当中，SMN2基因常常在第七外显子发生一个C到T的碱基突变，导致无功能的SMN2表达。通过将腺苷脱氨酶与Cas9结合而开创的腺嘌呤碱基编辑器（ABE），可以实现A 到 G（或 T 到 C）的转换，原则上可解决47%的基因致病突变导致的人类疾病^[16]，原理上也可用于纠正SMN2 C到T突变，恢复SMN2的全长表达，进而弥补SMA患者中SMN1蛋白的低表达，从而改善运动神经元的功能，达到SMA治疗作用。由于ABE可永久改变基因组，因此可以实现一次注射终身治愈的目的。

Benjamin P. Kleinstiver课题组于2023年1月21日在预印本网站bioRxiv 率先发表了应用ABE治疗SMA的动物实验结果，该结果证明了ABE在SMA治疗中的有效性和可靠性^[17]。该课题组前期自主开发了无 PAM 序列要求的 CRISPR-SpCas9 突变体——SpRY，可以在基因组上几乎任何序列上切割 DNA^[18]。该研究通过前期对不同Cas9蛋白、腺苷脱氨酶、sgRNA的组合筛选，作者发现当腺苷脱氨酶ABE8e与SpRY形成融合蛋白后，应用gRNA A8后可以实现其对SMN2 C6T 编辑的有效性，并明显较低了ABE8e-SpRY的旁观者效应（图三）。

图三ABE8e-SpRY 修复SMN2 C6T突变^[17]

接着作者将ABE8e-SpRY和gRNA A8转入人SMA患者来源的成纤维细胞中，发现其明显修正SMN2 C6T 突变，并提高SMN的蛋白表达水平。通过CHANGE-seq发现ABE8e-SpRY和gRNA A8在成纤维细胞中具有较低的脱靶率（图四）。鉴于ABE8e-SpRY过大和AAV载体的包装限制，Benjamin P. Kleinstiver等进一步利用Intein拆分的方法，将ABE8e-SpRY和gRNA A8分别构建到两个AAV载体中，拆分后ABE8e-SpRY的编辑效率与其原始版本类似。之后作者利用AAV9病毒将拆分后的ABE8e-SpRY和gRNA A8，通过脑室内注射的方法递送到SMN2 C6T 突变小鼠中。

图四、ABE8e-SpRY 脱靶分析^[17]

之后作者在包括大脑、脊髓、肝脏、心脏和骨骼肌在内的多个组织中观察到(SMN2 C6T) A-to-G编辑。在主要感兴趣的组织中，作者平均检测到~4%(脊髓)和~6%(大脑)的A-to-G编辑，和低水平的旁观者效应。然而由于作者用的这种SMA小鼠模型的寿命通常小于15天，ABE8e-SpRY和gRNA A8并未显著改善SMA模型小鼠表型。因此作者希望未来可以找到一种有较长生存期的SMA小鼠模型，用以评估该碱基编辑器对SMA的长期影响。但不过怎么样，目前结果已证明利用ABE编辑器可在SMA小鼠模型中实现了SMN2 C6T的体内编辑。

与其他已获批准的SMA疗法相比，以CRISPR为基础的基因组编辑技术可为一次注射永久治疗SMA提供了希望。2023年1月26日，CRISPR Therapeutics和Vertex公司旗下的一款基于CRISPR-Cas9，用于治疗镰状细胞病和β-地中海贫血的疗法已获得欧洲药品管理局（EMA）上市申请受理，并有望于今年在欧洲获得批准，成为首个上市的CRISPR-Cas9治疗药物。另外，基于ABE碱基编辑器，用以治疗家族性高胆固醇血症的VERVE-101疗法已于2022年进入临床一期，上述结果将为开发针对SMA的ABE治疗提供信心和基础。

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参考文献：

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3.Feldkötter, M., et al., Quantitative analyses of SMN1 and SMN2 based on real-time lightCycler PCR: fast and highly reliable carrier testing and prediction of severity of spinal muscular atrophy. 2002. 70(2): p. 358-368.

4.Valetdinova, K., V. Ovechkina, and S.J.B. Zakian, Methods for Correction of the Single-Nucleotide Substitution c. 840C> T in Exon 7 of the SMN2 Gene. 2019. 84: p. 1074-1084.

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12.Van Alstyne, M., et al., Gain of toxic function by long-term AAV9-mediated SMN overexpression in the sensorimotor circuit. 2021. 24(7): p. 930-940.

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15.Philippidis, A.J.H.G.T., Novartis Confirms Deaths of Two Patients Treated with Gene Therapy Zolgensma. 2022. 33(17-18): p. 842-844.

16.Cao, X., et al., Engineering of near-PAMless adenine base editor with enhanced editing activity and reduced off-target. 2022. 28: p. 732-742.

17.Alves, C.R., et al., Base editing as a genetic treatment for spinal muscular atrophy. 2023: p. 2023.01. 20.524978.

18.Walton, R.T., et al., Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. 2020. 368(6488): p. 290-296.

E.N.D

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